在细胞内重组表达目的蛋白的过程中，核酸是一类常见的杂质成分，尤其当目的蛋白具有核酸结合活性时，核酸污染更容易出现。目的样品中残留的、宿主细胞来源的核酸片段，可能会造成以下几方面的影响：

增加样品的黏度

在纯化过程中引入其他杂质，并且有可能影响目的蛋白的聚集状态

影响目的蛋白与靶标序列核酸的结合活性，从而影响后续的结合活性实验或者结晶实验等

从生物制药角度，一定长度的宿主DNA片段残留有致癌性，必须控制残留量。

因此，在进行蛋白纯化时，往往需要关注样品中的核酸含量。如果出现明显的核酸污染，则需要去除。可以在前期样品制备过程中就开始着手；也可以在后续纯化过程中进一步去除，通过核酸富含负电荷的性质以及核酸与蛋白的结合条件等方面入手。本文就将从样品准备和层析步骤两大方面，简要介绍核酸杂质去除的方法。

一

样品准备阶段的核酸去除

对于细胞裂解后的样品，沉淀是一种常用的技术，可以简便、快速地通过固液分离的方式对样品进行初步的纯化。此外，沉淀的方法还具有对样品体积限制小、成本相对可控等优点。利用核酸分子带有大量负电荷的特点，常用富含正电荷的物质与之形成电荷中和后的沉淀，从而除去核酸。这类富含正电荷的物质有很多，其中应用较多也很经典的就是PEI（，聚乙烯亚胺）。

1.PEI沉淀法除核酸

PEI聚乙烯亚胺（商品名为），是一种线性的聚合物，其重复单元的结构式为(––NH–)n，n值一般在700– 2000，聚合物整体分子量在30– 90 kDa。由于结构中存在大量重复的亚氨基结构，因此PEI在接近中性的溶液条件下富含正电荷。[1] [2]

图1. 聚乙烯亚胺PEI重复单元结构

基于这种带电性质，PEI可以与核酸或者酸性蛋白等带负电的生物分子发生吸附，形成复合物并引发絮凝，导致PEI与结合的生物分子共同沉淀。PEI与带负电分子之间的相互作用受到pH以及盐浓度的影响，提高盐浓度将减弱PEI与互作分子的结合。需要注意的是，从已经形成沉淀的PEI复合物中回收蛋白时，复溶蛋白的同时也会重新溶解PEI，此时降低盐浓度，蛋白与PEI之间又将结合在一起，因此需要继续提高盐浓度来沉淀蛋白而使PEI保持在上清中，进而完成分离。

在较低的离子强度（0– 0.1 M NaCl）下，DNA和大部分酸性蛋白将与PEI结合而沉淀；当盐浓度提高至0.1 – 1 M NaCl时，只有DNA以及带有大量负电的蛋白质会形成沉淀；在1 M NaCl以上时，只有DNA会形成沉淀了（DNA-PEI的结合一般要在1.4 – 1.6 M NaCl时才解离）。因此，PEI沉淀法主要有以下三种基本策略。[1]

策略一：在低盐条件下沉淀核酸与部分蛋白，在高盐条件下将目的蛋白从沉淀中重新溶解。这是较为普遍采用的一种策略，基本流程如下：首先在低盐浓度下沉淀核酸以及含有目的蛋白的组分，之后经过低盐浓度缓冲液的洗杂步骤后，使用高盐缓冲液将目的蛋白从沉淀中复溶。由于此时复溶得到的蛋白样品中还含有PEI，需要再经过硫酸铵沉淀的方式沉淀目的蛋白（PEI仍保持在上清中），最后将沉淀用缓冲试剂复溶就得到含有目的蛋白的粗纯样品了。

策略二：在低盐至中等盐浓度条件下沉淀核酸与部分酸性蛋白。该策略适用于纯化中性或者偏碱性的DNA结合蛋白：在PEI沉淀的盐浓度条件下，这些蛋白不具有DNA结合活性；PEI沉淀后，这些蛋白保留在上清中。

策略三：在高盐浓度下沉淀核酸。由于在高盐条件下，基本上只有核酸会与PEI结合而沉淀，从而去除蛋白样品中的核酸杂质。该策略并不常用，主要问题有：仅沉淀核酸，对于蛋白组分没有纯化作用；过量的PEI还是要通过硫酸铵沉淀的方式去除。

为了确定沉淀目的蛋白所需的PEI的量以及从沉淀中重新溶解目的蛋白所需的NaCl浓度，需要进行PEI沉淀和NaCl溶解测试。

以大肠杆菌提取物为例[1]，样品处于0.2 M NaCl，pH 7.9的条件下。将5% (w/v) PEI储液按不同比例加入样品，形成0 – 0.5% (w/v) 的PEI浓度梯度，孵育离心后，测定上清中蛋白的含量。从图2（A）的结果可以看到，在0.175% (w/v) PEI浓度下，目的蛋白基本完全沉淀，并且核酸以及约30%的总蛋白也一同沉淀。之后，经过该浓度PEI处理得到的沉淀样品使用含有不同NaCl浓度（0 – 1 M）的缓冲液进行复溶，并测定复溶缓冲液中的蛋白含量。结果如图2（B）所示，目的蛋白在0.5 M NaCl条件下仍处于沉淀中，而在1 M NaCl下基本完全复溶。最终确定的实验条件为：0.175% (w/v) PEI 沉淀，0.5 M NaCI清洗沉淀，1 M NaCI复溶。

图2. PEI沉淀曲线（A）与NaCl洗脱曲线（B）。白圈代表上清或洗脱液中总蛋白量，黑圈代表目的蛋白（E. coli RNA 的β’β亚基）的量。

2.其他可用于样品制备阶段核酸去除的试剂

除了上述的PEI之外，硫酸链霉素（例如1%）等试剂也可用于核酸的沉淀去除。此外，通过酶消化的方式也能去除核酸的污染。例如（降解DNA与RNA的核酶）或DNase I等，可以在样品制备的过程中加入，并配合更加充分的细胞裂解过程，在一定程度上解决长链核酸导致的黏度问题[3]。

二

层析阶段的核酸去除

如果在样品准备阶段未能有效去除核酸的污染，可以通过后续的层析纯化步骤去除，如亲和层析和离子交换、分子筛等。

1.填料纯化DNA结合蛋白

（肝素）是一类高度硫酸化的多糖，结构中存在大量的磺酸基与羧基，使其带有较强的负电荷。这种富含阴离子的结构在一定程度上模拟了链状的核酸，使得配基具有与DNA结合蛋白互作的功能。

图3. 肝素多糖结构单元示意图。（A）己糖醛酸；（B）D-葡萄糖胺

利用上述的结合特性，填料可以用于转录因子、核酸酶、DNA/RNA聚合酶等核酸结合蛋白的纯化。在下图展示的Oct-1转录因子的纯化方法中， HP的结合条件为含有500 mM NaCl的缓冲液。相对较高的盐浓度可以抑制目的蛋白与宿主核酸的结合，但Oct-1蛋白仍保有与配基的结合能力。经过后续高盐（2 M NaCl）缓冲液的洗脱，得到含有目的蛋白的样品[4]。

图4. 使用 HP预装柱对重组表达的Oct-1蛋白的纯化结果。

2.阴离子交换层析去除样品中的DNA

由于核酸分子带有大量的负电荷，在性质上与常规蛋白类的生物分子有显著的差异。因此，核酸可以与阴离子交换层析填料较紧密地结合，一般需要高盐才能洗脱，而大部分蛋白样品的洗脱盐浓度较低，因此可以通过设置不同的洗脱梯度，分离目的蛋白与核酸杂质；或者采取流穿模式，使目的蛋白不结合填料，从而与结合在填料上的核酸分离。

结合-洗脱模式案例：图5展示的是重组α-淀粉酶在阴离子交换层析填料Q XL上的纯化结果[5]。使用10 mM CaCl2沉淀去除部分DNA，之后，在0 – 1 M NaCl的线性洗脱梯度中，形成了两个主要的洗脱峰。其中第一个峰中含有目的蛋白，且DNA含量较低；第二个峰中主要为DNA杂质。

图5. 使用Q XL对大肠杆菌重组表达的α-淀粉酶进行捕获纯化的实验结果（中试规模）。下方表格的数据展示了纯化过程中不同组分的DNA含量。

流穿模式案例：对于部分样品，也可以采用流穿的模式进行样品中DNA的去除。其相比于结合-洗脱模式更加简单，适用性强；目的样品不需要经过结合-洗脱过程的缓冲液成分变化，更有利于保持其性质的稳定。下面展示的流感病毒VLP的纯化结果就可以说明[6]。

图6. Capto Q纯化H1N1 VLP的结果。

3.其他去除核酸的层析方法

除了上面提到的层析方法外，凝胶过滤层析或者复合模式填料（如Capto Core 700、）也可应用于核酸杂质的去除。例如在腺病毒纯化的案例中，在进行核酸酶的处理之后，两套工艺流程（Capto Q + Capto Core 700和 Q + 4 FF）的精纯步骤均可以进一步地去除HCP以及hcDNA（host cell DNA）[7]。同时，由于蛋白与核酸间的结合以电荷吸附的离子型相互作用为主，因此会受到环境的离子强度的影响。一般情况下，离子强度的增强将促进蛋白与核酸的解离，例如可以尝试0.5 – 2 M NaCl。另外，蛋白变性也是一种可以解离蛋白与核酸结合的方式。例如在CREB（cAMP ）转录因子的纯化中，加入了核酸酶的处理步骤，并且进行了变性、高盐（8 M尿素、1 M NaCl）条件下的凝胶过滤层析，纯化后再对目的蛋白进行复性，最终有效地改善了目的蛋白的核酸污染问题[8]。

综上，在蛋白纯化过程中，可以通过以下方法来去除核酸杂质：（1）在样品制备过程中通过沉淀或者酶解的方式去除；（2）通过特定的层析方法，例如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤、复合模式层析去除核酸污染；或者通过高盐、变性等条件，使蛋白与核酸解离，再通过后续纯化步骤去除。在面对较为复杂或者严重的核酸污染问题时，可以考虑多种去除方式组合的方案，以实现更加充分的核酸去除效果。

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