作者：微生态

编译：微科盟奇迹，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读海洋动物肠道菌群受其所生活的水和环境的影响。瓦氏雅罗鱼 (Leuciscus waleckii)适应高碱性环境，是研究碱性适应的理想材料。本研究对不同水生环境下的碱水种(AW)和淡水种(FW)瓦氏雅罗鱼肠道指示菌群和肠道菌群功能冗余进行了筛选。然后通过与环境水样中所含的菌群进行对比来预测与群落组成的相关性。根据可分类序列，共鉴定出5个种和6个属。存在于AW和FW中的肠道微生物群在各自的水环境中具有约1/3的操作分类单元，这意味着水环境中的肠道微生物与AW和FW中的肠道微生物有重要的联系。与FW肠道和淡水中的细菌组成相比，AW肠道和碱性水样中Moraxella osloensis、Psychrobacter maritimus和Psychrobacter faecalis显著富集。在FW肠道和淡水样本中，Cryptomonas curvata和Polynucleobacter asymbioticus丰度显著提高，其中Enterobacter sp.为AW肠道的优势菌群，而Aeromonas和Ralstonia则主要存在于FW肠道中。光合细菌在两种水样中均显著。结果表明，AW和FW的肠道菌群组成、丰度和多样性存在较大差异。相比之下，碱性水环境和淡水环境的微生物组成略有差异。本研究旨在提高我们对瓦氏雅罗鱼耐碱性的认识，为碱性水鱼类的养殖提供依据，促进碱性水资源的高效开发。

论文ID

原名：Microbiota Comparison of Amur ide (Leuciscus waleckii) Intestine and Waters at Alkaline Water and Freshwater as the Living Environment

译名：碱性水和淡水环境下瓦氏雅罗鱼肠道和水体微生物群比较

期刊：Frontiers in Microbiology

IF：6.064

发表时间：2022.5

通讯作者：梁利群

通讯作者单位：中国水产科学研究院黑龙江水产研究所

DOI号：10.3389/fmicb.2022.881132

实验设计

图1 样品的地理分布。圆圈代表了采样位置，包括达里诺尔湖的碱水物种(AW)和汤旺河的淡水物种(FW)。

结果

1序列统计分析

利用Illumina MiSeq平台，对所有样本细菌的16S rRNA基因V3-V4区进行测序，分别分析碱性水和淡水中AW和FW肠道的微生物群。初始数据质量和嵌合过滤提供了883,017条高质量测序reads，这些数据来自分成4组的12个样本(每组3个样本)，每个样本10条鱼(表1)。在图2中，细菌物种丰富度和多样性被划分为4组：与OTU水平相关的ACE、Chao、Shannon和Simpson指数。Shannon指数和Simpson指数常用来量化生物多样性。采用Chao指数和ACE指数测定各样本的物种丰富度。ACE估计量范围为677.729 ~ 1224.136，Chao估计量范围为727.238 ~ 1226.519，Shannon估计量范围为5.390 ~ 7.079，Simpson估计量范围为0.930 ~ 0.989(表1)。这些都有显著差异(P＜0.05)，遗传距离为3%。结果表明，与淡水组相比，碱性水组的微生物丰富度和多样性显著降低。每个样本中Good’s覆盖率平均值为99.3325%，表明所发现的序列可以代表每个组中的大多数微生物。t检验的数据见附录S1。

表1 相对于每个样本的丰富度和多样性指数(OTU截断值为0.03)a。

aOTUs定义在97%相似水平(阈值为0.03)。bDL代表达里诺尔湖，TR代表汤旺河，G代表瓦氏雅罗鱼肠道，S代表水。

图2 4个分组中细菌的丰富度和多样性。(A-D)分别是OTU水平的Ace、Shannon、Simpson和Chao指数。* 代表 0.01 P ≤ 0.05，**代表 0.001 P ≤ 0.01，*** 代表 P ≤ 0.001。

2细菌群落结构

图3A中总结了来自碱性水和淡水类群的所有样本肠道细菌的主要门和属的相对丰度，并将已知的序列类群标记为others。所有样本的菌门丰度降序排列：变形菌门(30.07%)放线菌门(17.52%)Oxyphotobacteria(16.25%)拟杆菌门(13.40%)浮霉菌门(5.88%)其他(4.54%)疣微菌门(4.42%)。 对操作分类单元(OTU)丰度进行归一化。接下来，基于归一化输出数据进行α和β多样性分析。图3B中的维恩图用于识别上述四组中突出的OTUs，以探索碱性水和淡水环境中肠道和水体类型之间所有样品中的重要微生物组。DLG、DLS、TRG和TRS之间共享284个OTUs(n = 3)，占总reads的4.64%：按OTU数量排序为TRSDLGTRGDLS，高质量序列以97%的相似度水平分为1467个OTUs(图3B)。其中，基于淡水组内730个OTU的相似性，鉴定出碱性水组(DLG和DLS)中的601个OTU。虽然完全定义了瓦氏雅罗鱼(DLG和TRG)肠道样本中的1024个OTU(特有OTU分别为1182和896个)，但基于比碱性水和淡水(DLS和TRS)中总共443个OTU更显著的相似性，特有OTU数量分别为428和789个。 四个分组(DLG、DLS、TRG和TRS)中的主要细菌如图4A所示。根据微生物的相对丰度，由高到低排列为4个组：(a) DLG(图4B)，浮霉菌门(19.68%)＞放线菌门(17.78%)＞Oxyphotobacteria(17.47%)＞变形菌门(16.85%)＞厚壁菌门(10.57%)＞疣微菌门(9.89%)＞拟杆菌门(3.68%)＞其他(2.53%)＞Deinococcus-Thermus(0.92%)＞Tenericutes(0.62%)＞Armatimonadetes (0.01%)：(b) DLS(图4C)占10%以上，放线菌门(28.23%)＞拟杆菌门(25.58%)＞Oxyphotobacteria(21.40%)＞变形菌门(16.39%)：(c)对于TRG(图4D)， 变形菌门占绝对优势(63.89%)，厚壁菌门占DLG的20.50%，其他细菌的总比例为15.61%：(d) TRS(图4E)主要真菌占比相对平均，4个细菌门丰度在20%以上：Oxyphotobacteria (24.98%)＞变形菌门(23.15%)＞放线菌门(22.14%)＞拟杆菌门(20.85%)：(e)四组样本的聚类结果显示，每组之间的差异很小，(图4F，G)，说明检测结果具有高度相关性和可靠性。

图3 所有样品在门水平上的细菌群落(A)和四组OTUs的维恩图比较(B)。其他是指相对门或属的总和。

图4 门水平的微生物群组成(A E)、OUT水平的细菌群落主坐标分析(PCoA)(F)和四组间的层次聚类树(G)。四组(A)和DLG(B)、DLS(C)、TRG(D)和TRS(E)中细菌类群在门水平的微生物组成。每组3个样本，每个样本10条鱼。采用UPGMA方法计算分层聚类树。采用Bray距离和平均聚类法确定样本间的关系。

3筛选敏感微生物以确定生存状态

一些研究人员应用多项式logit模型分析了指示种群的预测精度，发现在拟杆菌科水平上预测结果有很高的准确率。按照该方法，本研究采用指示性评估过滤细菌属(图5)和门(图6)的变异，分别反映了AW和FW在碱性水和淡水中的生存状况。我们选择了指示值 0.90的群落。为了提高结果的准确性，我们筛选了15个科，在所有样本中都显示了指示科的特征。在属水平上，9个优势属中有4个属的差异有统计学意义(P＜0.05)，即Aeromonas (图5B)、Flavobacterium(图5C)、Fluviicola (图5D)、Unidentified_Synechoccales (Figure 5F)和Unidentified_Oxphotobacteria (图5G)。TRS、DLS和DLG与TRG相比Flavobacterium和Polynucleobacter存在差异显著(P0.001)，但DLS:TRS、DLG:TRS和DLG:DLS三组间无统计学显著差异。Fluviicola变化与前者相似，但TRS:TRG、TRS:DLG和TRS:DLG组的显著增幅较低(P0.05)。此外，Unidentified_Synechoccales中有3组(TRS:TRG、DLS:TRG、DLS:DLG)显示出显著差异(P 0.001)，而Unidentified_Oxyphotobacteria中TRS:DLG显示出显著增加(P 0.01)，关于四组之间属水平相对丰度的其他信息可参见附录S2。 8个优势门中有3个有统计学差异(P＜0.05)，即拟杆菌门(Bacteroidetes，图6B)、厚壁菌门(Firmicutes，图6C)和疣微菌门(Verrucomicrobia(图6F)。与TRG相比，变形杆菌在TRS、DLS和DLG(图6E)三个分组中存在显著差异(P 0.001)，与TRG相比，Oxyphotobacteria 在TRS(P 0.05)、DLS(P 0.05)和DLG三个分组(P 0.1)(图6D)略有变化。然而，三个分组(DLS：TRS，DLG：TRS和DLG：DLS)之间没有统计学显著差异。在Planctomycetes(图6G)中，变化与前者相似。然而，在三组DLG：DLS，TRS：DLG和TRS：DLG中观察到显著增加(P 0.001)。拟杆菌中的四组(DLS：DLG，DLS：TRG，TRS：DLG和TRS：TRG)显示出显著差异(P 0.05)，两组(TRG：TRS和TRG：DLS)在Fimticutes中以相似的水平增加，TRG：TRS和TRG：DLS组显示出显著增加(P 0.05)。在疣微菌门中，DLG：TRG(P 0.001)、DLS：TRS(P 0.05)和DLG：DLS(P 0.05)显著增加，有关四个分组在门水平上相对丰度的更多信息参见附录S3。

图5 在属水平上，(A)碱性水和淡水环境下肠道和水中细菌丰度的比较。属水平的单因素方差分析柱状图：(B) Aeromonas，(C) Flavobacterium，(D) Fluviicola，(E) Polynucleobacter，(F) unidentified_Synechococcales，(G) unidentified_Oxyphotobacteria。*表示0.01＜P≤0.05。

图6 在门水平上，(A)碱性水和淡水环境下肠道和水中细菌丰度的比较。门水平的单因素方差分析柱状图：(B)拟杆菌门，(C)厚壁菌门，(D) Oxyphotobacteria，(E)变形菌门，(F)疣微菌门，(G)浮霉菌门。*表示0.01＜P≤0.05。

4功能预测

PICRUSt显示肠道菌群功能发生显著变化。与分类谱相比，从样本中预测的主要功能被分为11个部分，在所有4组中都表现出更多的相似性。可以根据图7中总结的百分比，对预测的功能进行优先排序，以定义肠道微生物的功能。未知功能(33.12-33.99%)＞膜转运(9.81-12.89%)＞氨基酸代谢(9.87-11.15%)＞碳水化合物代谢(9.71-10.28%)＞复制和修复(6.98-7.61%)＞能量代谢(5.35- 7.55%)＞缺失的功能描述(4.92-5.20%)＞辅因子和维生素代谢(4.10-5.04%)＞翻译(4.19-4.88%)＞脂质代谢(3.45-3.86%)＞细胞过程和信号传导(3.21-4.02%)。这些结果表明，胃肠道微生物组表现出与碱性水或淡水中发现的相似的生物学作用。许多代谢活动由微生物膜运输、氨基酸代谢、葡萄糖代谢、能量代谢、复制和修复辅助完成。

图7 四个分组的KEGG功能预测。

讨论

高通量筛选技术 被广泛用于检测少数微生物种群。与以前检测肠道微生物的研究相比，例如传统培养技术和基于细菌16S rRNA基因的DGGE和T-RFLP，高通量筛选技术可以准确地响应微生物群落组成。本研究利用Illumina高通量测序技术，检测了瓦氏雅罗鱼在碱性水和淡水环境下AW和FW肠道细菌群落组成的差异。 一些研究表明，肠道微生物对宿主的发育和生长具有巨大的影响，不仅可以保持饮食中适当的能量产量，还可以暗示生物多样性，并为不断变化的肠道微生态环境提供建设性的预测。本研究对碱性水和淡水生态系统中瓦氏雅罗鱼的肠道细菌多样性进行了研究，发现在碱性水中瓦氏雅罗鱼肠道细菌中最丰富的是Moraxella osloensis、Psychrobacter maritimus和Psychrobacter faecalis。Pseudomonas anguilliseptica、Nitrincola nitratireducens、Rhodonellum ikkaensis、Flavobacterium lacus和Alishewanella tabrizica在碱性水生态系统中显著富集。其中，石斑鱼肠道中的Psychrobacter sp.可以作为益生菌，抑制多种常见病原体的生长。在饲料中添加该菌可显著提高石斑鱼的食物利用率，增强动物的免疫功能。在本研究中，Psychrobacter maritimus、P. faecalis和P. anguilliseptica属于嗜冷芽孢杆菌属，说明它们是鱼类肠道内容物中的优势菌。嗜冷芽孢杆菌属喜好低温，即使在冷藏环境中也具有旺盛的生长活性，对培养低温微生物具有很大的应用价值。该结果在Brachymystax lenok中得到验证。在本研究中，瓦氏雅罗鱼肠道细菌群落中大多数门的相对丰度在碱性水和淡水中没有显著差异。 水生生物、生长期、生态环境、饲料和摄食策略以及消化生理特性都会影响鱼类肠道微生物组的组成、数量和结构。尽管鱼类在进化早期肠道菌群的组成和比例尚不清楚，但据推测，肠道细菌动态平衡的破坏经常伴随着宿主疾病的出现。虽然不同鱼类的肠道菌群不同，但这些微生物群落具有相似的生物活性。这项研究发现，在肠道细菌的调整之前，AW肠道及其碱性水中的菌群发生了重大变化。然而，不同碱性水和淡水环境的微生物混合物差异不大。这表明细菌群落的结构和功能相似性之间存在显著的正相关关系，并且瓦氏雅罗鱼肠道菌群的功能冗余相对较低。因此，预测的实际基因组变化与水生环境中微生物菌落的形态是一致的。在本研究中，达里诺尔湖AW肠道菌群的功能主要集中在转录、甲烷代谢和氨基酸代谢方面。 同时，汤旺河FW部分肠道菌群主要集中在离子转运、蛋白质修复和细菌流动等方面。这说明在高耐碱生理过程中，整个AW中细菌丰度降低，多能量代谢能力减弱。此外，生理和代谢功能也会减慢。因此，AW参与许多消化和生理吸收过程，如氨基酸和碳水化合物代谢，以提供足够的时间逐渐适应高碱性水。 此外，在达里诺尔湖的高碱性水体中，微生物的功能主要集中在氨基酸(如丝氨酸、甘氨酸和苏氨酸)代谢方面。相比之下，汤旺河淡水中的FW微生物部分主要集中在丙酮酸盐和胆固醇丁酸盐代谢上，这表明AW在高碱性水耐碱过程中促进氨基酸代谢并间接加速酶活性。如过氧化物酶可以利用过氧化氢酶的氧化还原反应发挥解毒作用，过氧化氢酶也参与脂质合成。因此，高耐碱性的出现可能与肠道菌群的变化有关，肠道菌群的变化缓解了消化吸收和能量代谢相关功能，使AW对高碱性水产生强烈的感觉，有足够的时间适应。由于缺乏参考文献，我们目前无法确定肠道群落组成、功能和耐碱性增加之间的因果关系，但本研究证明的它们的密切相关性证实了肠道微生物在维持宿主高耐碱性方面的关键作用，值得进一步研究。

结论

生活在碱性环境下的瓦氏雅罗鱼AW与生活在淡水环境下的瓦氏雅罗鱼FW在肠道微生物群落结构上存在显著差异，代谢发生了巨大变化，表明其肠道微生物功能冗余度较低。这些变化与它们的生长水环境相一致。同时检测肠道敏感指示菌的生存情况。虽然我们目前还不能确定肠道菌群组成、功能和生长水环境之间的因果关系，但这三个参数之间的密切关系证实了消化微生物在宿主生理中的关键作用。

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